本发明属病毒遗传操作领域，具体涉及一种新城疫病毒（NDV）耐热活疫苗载体系统及其应用。本发明包括：a) 转录质粒，通过将NDV耐热疫苗株的基因组全长cDNA克隆至pBR322载体中获得；b) 三个辅助质粒，分别将NDV 耐热疫苗株的核蛋白、磷蛋白和大聚合酶蛋白基因克隆至pcDNA3.1载体中获得；c) 宿主细胞。通过基因操作手段，可将外源基因，如绿色荧光蛋白（GFP）基因插入至上述转录质粒的特定位点，将插入有GFP基因的转录质粒和三个辅助质粒共转染至宿主细胞后，通过增殖培养，即可人工获得表达外源GFP基因的新城疫病毒耐热疫苗株。与现有技术相比，本发明的最大特点是人工获得的重组新城疫病毒具有耐热特性，也是首次建立的具有耐热特性的新城疫病毒活疫苗载体系统。本发明将在新城疫、禽流感等禽类主要疫病的多联（多价）耐热基因工程活疫苗的研发、病毒耐热机理的研究等方面具有极大的应用前景。